Η ΣΚΟΤΕΙΝΗ ΠΛΕΥΡΑ ΤΩΝ ΦΥΤΩΝ

Καρυώτη Ε., Σ. Ρήγας και Π. Χατζόπουλος

Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας, Τμήμα Γεωπονικής Βιοτεχνολογίας, Γεωπονικό Πανεπιστήμιο Αθηνών, Ι. Οδός 75, 11855-Αθήνα

Η επιδερμίδα της ρίζας στο φυτό Arabidopsis thaliana, λόγω της απλής δομής και οργάνωσης που παρουσιάζει, έχει καθιερωθεί και χρησιμοποιεί-ται ως μοντέλο για τη μελέτη σε μοριακό και γενετικό επίπεδο της κυτταρι-κής διαφοροποίησης. Δύο τύποι επιδερμικών κυττάρων εμφανίζονται: κύτταρα, τα οποία δεν αναπτύσσουν ριζικά τριχίδια οι ατριχοβλάστες και κύτταρα, τα οποία αναπτύσσουν ριζικά τριχίδια οι τριχοβλάστες. Το γονίδιο ΤRΗ1  απομονώθηκε από το φυτό Arabidopsis. Τα μεταλλαγμένα φυτά έχουν φαινότυπο μικροσκοπικών ριζικών τριχιδίων trh1 (tiny root hair) και δημιουργήθηκαν με ένθεση T-DNA. Το γονίδιο κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη μεταφορέα Κ⁺ που σχετίζεται με κανάλι υψηλής συγγένειας απορρόφησης του ιόντος.

Διπλά μεταλλαγμένα φυτά, που φέρουν τη μετάλλαξη στο γονίδιο TRH1 και κάθε μία από τις μεταλλάξεις στα γονίδια CPC, TTG, CTR1, GL2, RDH6 και RHD3 που επηρεάζουν την ανάπτυξη του ριζικού τριχιδίου, δημιουργήθηκαν ώστε να χρησιμοποιηθούν για την ανάλυση σε γενετικό και μοριακό επίπεδο του γονιδίου TRH1. Ελέγχθηκαν με αυτό τον τρόπο οι πιθανές μοριακές αλληλεπιδράσεις μεταξύ των χαρακτηρισμένων μεταλλάξεων και της μετάλλαξης στο γονίδιο TRH1. Για την επιλογή των διπλών μεταλλαγμάτων χρησιμοποιήθηκε η αντίδραση της PCR ώς μοριακού δείκτη, η ανθεκτικότητα στην καναμυκίνη, ενώ τα διπλά μεταλ-λαγμένα φυτά μελετήθηκαν ως προς το φαινότυπο του ριζικού τριχιδίου.

Βρέθηκε ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ των γονιδίων TTG, GL2, CPC, CTR1, RHD3 και TRHI είναι προσθετική, γεγονός που οδηγεί στο συμπέρασμα ότι τα παραπάνω γονίδια δρούν σε παράλληλα ή ανεξάρτητα οντογενετικά και αναπτυξιακά μονοπάτια. Το γονίδιο  RHD6 εμφανίζει επιστατική δράση έναντι του γονιδίου TRH1, με το γονίδιο RHD6 να δρα πριν από το γονίδιο TRH1 στο μονοπάτι της ανάπτυξης του ριζικού τριχιδίου.

ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΤΟΥ ΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΤΟΠΟΥ ΤΗΣ ΕΛΑΦΡΙΑΣ ΑΛΥΣΙΔΑΣ ΤΗΣ ΔΥΝΕΪΝΗΣ ΣΤΟ ΦΥΤΟ Arabidopsis thaliana

Σαμακοβλή Δ., Σ. Αργυρός και Π. Χατζόπουλος

Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας, Τμήμα Γεωπονικής Βιοτεχνολογίας, Γεωπονικού Παν/μίου Αθήνας, Ιερά οδός 75, 118 55 - Αθήνα

Η χαρτογράφηση του 4ου χρωμοσώματος του φυτού Arabidopsis thaliana στα πλαίσια του προγράμματος ESSA, στο οποίο συμμετείχε και το Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας του ΓΠΑ, έφερε στο φως τρία γονίδια χαρακτηριστικό των οποίων είναι η πολύ μικρή μεταξύ τους απόσταση πάνω στο γονιδίωμα του φυτού. Τα γονίδια αυτά είναι το 2111 που κωδικοποιεί την ελαφριά αλυσίδα της δυνεΐνης , το 7111 που κωδικοποιεί ένα ένζυμο καταβολισμού και το 8111 που κωδικοποιεί μια υπομονάδα της RNA πολυμεράσης.

Για τον εντοπισμό των επιπέδων έκφρασης των μεταγραφημάτων  σε διάφορους φυτικούς ιστούς και αναπτυξιακά στάδια του φυτού χρησιμοποιήθηκε η ανάλυση κατά Northern με RNA που απομονώθηκε από φύλλα, άνθη, νεαρές και ώριμες ταξιανθίες, ρίζες και ολόκληρες ροζέτες, καθώς και ολικό RNA  από σπορόφυτα διαφόρων αναπτυξιακών σταδίων. Για τη συμπλήρωση των γονιδίων χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της 5΄ RACE και 3΄ RACE αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης, αντίστοιχα.

Για τη μελέτη της τοπικής της έκφρασης χρησιμοποιήθηκε η τεχνική του in situ υβριδισμού. Τα αποτελέσματα της τελευταίας μελέτης έδειξαν υψηλά επίπεδα έκφρασης σε ιστούς που παρουσιάζουν είτε έντονη μεταβολική δραστικότητα, όπως παρεγχυματικά κύτταρα και αγωγά στοιχεία είτε έντονη αναπτυξιακή δραστικότητα, όπως ακραία μεριστώματα βλαστού και ρίζας. Τα παρόμοια αποτελέσματα που προέκυψαν από τη μελέτη της έκφρασης των τριών αυτών γονιδίων τόσο με τη μέθοδο της ανάλυσης κατά Northern όσο και με τη μέθοδο του in situ υβριδισμού συνομολογούν πιθανή συντονισμένη ρύθμιση των τριών γονιδιακών προϊόντων σε μεταγραφικό επίπεδο για την αντιμετώπιση των αυξημένων αναγκών σε ενέργεια, ενζυμική δραστικότητα και μεταφορά δομικών στοιχείων κυτταροσκελετού στα κύτταρα των ιστών αυτών.

 ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΕΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΜΕΤΑΞΥ ΕΝΕΡΓΟ-ΠΟΙΗΤΩΝ ΚΑΙ ΚΑΤΑΣΤΟΛΕΩΝ ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ ΣΤΟ ΣΑΚΧΑΡΟΜΥΚΗΤΑ (S. Cerevisiae)

Παπαμίχος-Χρονάκης Μ. και Δ. Τζαμαρίας

Ινστ. Μορ. Βιολ. & Βιοτεχνολογίας και Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Κρήτης, Ηράκλειο 711 10

Το πρωτεϊνικό σύμπλοκο Cyc8-Tup1 λειτουργεί ως γενικός μεταγραφικός καταστολέας πολλών ασύνδετων γονιδίων της ζύμης. Ενώ πληθώρα πειραματικών δεδομένων υποδεικνύουν τις μοριακές αλληλεπιδράσεις που οδηγούν σε μεταγραφική καταστολή, ο μηχανισμός  που επιτρέπει άμεση μεταγραφική απο-καταστολή, όταν αυτή φυσιολογικά απαιτείται, παραμένει άγνωστος. Χρησιμοποιώντας τη μέθοδο των δύο υβριδίων κλωνοποιήσαμε  το γονίδιο μιας νέας πρωτείνης (Cti6p), η οποία αλληλεπιδρώντας in vivo με το σύμπλοκο Cyc8-Tup1 εξασφαλίζει άμεση μεταγραφική απο-καταστολή. Γενετική και βιοχημική ανάλυση, αλλά και πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης απέδειξαν ότι η πρωτείνη Cti6p ανταγωνίζεται τη κατασταλτική -στη μεταγραφή- δράση του συμπλόκου Cyc8-Tup1 αλληλεπιδρώντας με το σύμπλοκο Gcn5/SAGΑ. Τα πειραματικά μας δεδομένα υποδεικνύουν ότι το σύμπλοκο Gcn5/SAGA, μέσω αυτών των αλληλεπιδράσεων, οδηγείται στο DNA των υποκινητών και ακετυλιώνοντας τα αμινικά άκρα των ιστονών Η3, συμβάλει στη χαλάρωση της χρωματινικής δομής και στη μεταγραφική ενεργοποίηση.

ΜΟΝΤΕΛΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΤΡΙΣΔΙΑΣΤΑΤΗΣ ΔΟΜΗΣ ΤΗΣ ΠΕΡΙΟΧΗΣ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ  Ssn6  ΠΟΥ ΠΡΟΣΔΕΝΕΤΑΙ

ΜΕ ΤΗΝ ΠΡΩΤΕΪΝΗ Τup1

Τάρτας¹ A., X-K. Τσαπαρδώνης¹, Δ. Γιαννουκάκος², Δ. Τζαμαρίας³ και Μ. Βλάση¹

¹Ινστιτούτο Βιολογίας, ²Ινστιτούτο Ραδιοϊσοτόπων & Ραδιοδιαγνωστικών Προϊόντων, ΕΚΕΦΕ "Δημόκριτος", Αγ. Παρασκευή Αττικής, ³Ινστιτούτο Μοριακής Βιολογίας & Βιοτεχνολογίας, Ηράκλειο Κρήτης

Η πρωτεΐνη Ssn6 αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη Tup1 και το σχηματιζόμενο σύμπλοκο δρα ως γενικός καταστολέας της μεταγραφής ενός μεγάλου αριθμού οικογενειών γονιδίων του Saccharomyces cerevisae. Η καταστολή της μεταγραφής απαιτεί επιπλέον την αλληλεπίδραση του συμπλόκου με, ειδικές για κάθε οικογένεια ρυθμιζόμενων γονιδίων, πρωτεΐνες-καταστολείς. Σε όλες τις παραπάνω πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις εμπλέκο-νται περιοχές της Ssn6 γνωστές με το όνομα TPRs (TetratricoPeptide Repeats). Ο μηχανισμός καταστολής της μεταγραφής μέσω TPR σχημα-τιζόμενων συμπλόκων, έχει προταθεί ότι είναι εξελικτικά συντηρημένος.

Στην εργασία αυτή έγινε μοντελοποίηση της τρισδιάστατης δομής των 3 αμινοτελικών TPRs  της Ssn6 που είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στην αλληλεπίδρασή της με την Tup1. Η μοντελοποίηση έγινε χρησιμοποιώντας ως πρότυπο τη γνωστή δομή μιας άλλης TPR πρωτεΐνης, της φωσφατάσης 5. Επιπλέον, με πειράματα τυχαίας μεταλλαξιγέννεσης, εντοπίστηκαν  σημειακές μεταλλάξεις της Ssn6 που παρεμποδίζουν τον σχηματισμό του Ssn6/Tup1 συμπλόκου. Στον εντοπισμό των μεταλλάξεων αυτών χρησιμοποιήθηκε η ιδιότητα της Ssn6 να μετατρέπεται από καταστολέας της μεταγραφής σε ενεργοποιητή, απουσία της Tup1.

Το προτεινόμενο μοντέλο, σε συνδυασμό με τα πειράματα μεταλλαξι-γέννεσης, έδειξε ότι, 1) υπεύθυνα για την αλληλεπίδραση της Ssn6 με την Tup1 είναι η δομική ακεραιότητα του πρώτου TPR και η σχετική του θέση ως προς τα άλλα δύο, που απλά σχηματίζουν τη δομική βάση στην οποία στηρίζεται το TPR1 και 3) η αλληλεπίδραση των δύο αυτών πρωτεϊνών έχει υδρόφοβο χαρακτήρα.

Η παρούσα εργασία χρηματοδοτείται από τα προγράμματα "Δημοέρευνα 99" (ΕΚΕΦΕ "Δ") και ΠΕΝΕΔ99 (ΓΓΕΤ).

Dj2 ΕΝΑΣ ΠΙΘΑΝΟΣ ΣΥΝΕΡΓΑΤΗΣ ΤΗΣ hsc70 ΣΤΙΣ ΚΥΤΤΑΡΟ-ΠΛΑΣΜΑΤΙΚΕΣ ΝΑΝΟΜΗΧΑΝΕΣ ΤΩΝ hsp70s

Μποζίδης Π., Ι. Λαζαρίδης, Γ.Ν. Παγουλάτος, και Χ.Ε. Αγγελίδης

Εργ. Γενικής Βιολογίας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων, Ιωάννινα 45110

Οι μοριακοί συνοδοί είναι υψηλά συντηρημένες πρωτείνες οι οποίες συμμετέχουν σε βασικές κυτταρικές διαδικασίες όπως η αναδίπλωση νεοσυντιθέμενων πρωτεινών, η μετακίνηση των πρωτεινών δια μέσω των μεμβρανών κι η σταθεροποίηση συγκεκριμένων πρωτεινικών δομών. Οι παραπάνω λειτουργίες επιτυγχάνονται με το σχηματισμό νανομηχανών στις οποίες ενεργά συμμετέχουν επίσης και μια σειρά άλλων πρωτεινών που καλούνται συν-συνοδοί. Στα κύτταρα των θηλαστικών η οικογένεια των μοριακών συνοδών της hsp70 περιλαμβάνει δύο κυτταροπλασματικά μέλη εκ των οποίων το ένα, που καλείται hsc70, εκφράζεται συνεχώς, ενώ το άλλο, που καλείται  hsp70, εκφράζεται μετά από θερμοκρασιακό σοκ. Eχει δειχθεί ότι η λειτουργία των δύο μελών ρυθμίζεται από μέλη μιας οικογένειας συν-συνοδών γνωστής ως DnaJ, αλλά δεν είναι διευκρινισμένο ακόμη πoια συγκεκριμένα μέλη αυτής της οικογένειας αλληλεπιδρούν in vivo είτε με την hsc70 είτε με την hsp70. Αναφέρουμε εδώ την κλωνοποίηση ενός πλήρους cDNA πιθήκου μήκους 2,3Kb το οποίο κωδικοποιεί για πρωτείνη ομόλογη με μια ανθρώπινη DnaJ πρωτείνη που καλείται dj2. Η ανάλυση κατά Northern σε διάφορες κυτταρικές σειρές απεκάλυψε την ύπαρξη δύο mRNAs τα οποία διαφέρουν ως προς το μέγεθος τους, με το μεγαλύτερο μήνυμα να έχει μια επιπλέον αλληλουχία μήκους 0,9Kb στην 3΄ μη μεταφραζόμενη περιοχή του. Δείχνουμε επίσης ότι τα δύο mRNAs έχουν σαφώς διαφορετική κατανομή σε διάφορους ιστούς παρόλο που οι χρόνοι ημιζωής των δύο μεταγράφων βρέθηκε να μην διαφέρουν σημαντικά. Χάρη στον κλώνο των 2,3Kb παρασκευάσαμε και απομονώσαμε την ανασυνδυασμένη πρωτείνη από κύτταρα  E.coli. Αυτή χρησιμοποιήθηκε ως αντιγόνο για την ανάπτυξη πολυκλωνικών αντισωμάτων έναντι της dj2. Ανάλυση κατά Western έδειξε ότι η πρωτείνη dj2 επάγεται ελαφρώς και συσσωρεύεται στους πυρήνες κατά το θερμοκρασιακό σοκ. Επίσης πείραματα ανοσοκαταβυθίσεων κάτω από τις ίδιες συνθήκες φανέρωσαν ότι η dj2 συγκαταβυθίζεται με την hsc70 κι όχι με την hsp70. Τα δεδομένα αυτά δείχνουν ότι η dj2 είναι ο πιθανός συνεργάτης της hsc70.

ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΗΝ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΕΝΔΟΓΕΝΩΝ ΑΝΤΙΣΤΡΟΦΩΝ ΜΕΤΑΓΡΑΦΑΣΩΝ ΚΑΙ ΤΩΝ ΡΕΤΡΟΙΙΚΩΝ ΣΤΟΙΧΕΙΩΝ VL30 ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΑ NIH3T3

Ευταξία Σ. , Ταβουλάρη Σ., Χατζή Ε. και Τζαβάρας Θ.

Εργαστήριο Γενικής Βιολογίας,Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Ιωαννίνων, Ιωάννινα 45110

Τα VL30 είναι μεταθετά στοιχεία με δομή παρόμοια των ρετροιών και απαντούν σε 100-200 αντίγραφα στο γονιδίωμα του ποντικού. Έχουν μήκος 5-6 Kb χωρίς ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης των γονιδίων gag, pol ενώ απουσιάζει το γονίδιο env και στερούνται αναπαραγωγικού κύκλου. Μετατίθενται όπως και τα ρετροιικά στοιχεία Ty, IAP, LINE μέσω ενός ενδιάμεσου RNA και τη δράση του ρετροιικού ενζύμου αντίστροφη μεταγραφάση (RT) που καταλύει την μεταγραφή του γενωμικού RNA σε DNA. Σκοπός της μελέτης ήταν η διερεύνηση της δράσης παραγόντων που μπορούν να επάγουν τα γονίδια των ενδογενών αντίστροφων μεταγραφασών και των στοιχείων VL30 σε κύτταρα ποντικού NIH3T3. Η εισαγωγή και υπερέκφραση ενός μεταλλαγμένου γονιδίου mp53, με κυριαρχικά αρνητική λειτουργία, σε κύτταρα NIH3T3 προκαλεί την επαγωγή της έκφρασης τόσο των ενδογενών RT όσο και των VL30 10-30 φορές ως προς το μάρτυρα. Η επίδραση των στεροειδών ορμονών οιστραδιόλης, D.E.S. και προγεστερόνης επάγει μόνο την έκφραση των VL30, ενώ η δεξαμεθαζόνη στη συγκέντρωση 5Χ10^-8Μ επάγει συγχρόνως και τα ενδογενή γονίδια RT περίπου 10 φορές. Η δράση των παραγόντων: κεραμιδίου, βαναδίου και 5’-αζακυτιδίνης, που προκαλούν γενωμική αστάθεια, επάγουν τις ενδογενείς RT έως 10 (40μM-24h), 20 (100μM-24h) και 300-500 (40μg/ml-48h) αντίστοιχα. Η δε έκφραση των VL30 επάγεται διαφορικά στην συγκέντρωση κεραμιδίου (200μM), βαναδίου (50μM), ενώ ταχύτερα στην 5’-αζακυτιδίνη (4h) με μέγιστη επαγωγή στις 20, 30 και 50 φορές αντίστοιχα. Τα αποτελεσματά μας δείχνουν ότι η: διαταραχή του κυτταρικού κύκλου από το μεταλλαγμένο γονίδιο mp53, δράση της δεξαμεθαζόνης, απομεθυλίωση και παράγοντες θραύσης DNA/απόπτωσης επάγουν τις ενδογενείς αντίστροφες μεταγραφάσες και αποτελούν ισχυρή ένδειξη για την αύξηση της συχνότητας του φαινομένου της ρετρομετάθεσης.

Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΧΡΩΜΑΤΙΝΗΣ ΣΤΗΝ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΩΝ PHO5 ΚΑΙ PHO3 ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΤΟΥ Saccharomyces cerevisiae

Πολίτης¹ Π.Κ., C. M. Campa², N. Kent¹, C. R. Goding² and J. Mellor¹

¹Τμήμα Βιοχημείας, Oxford University, Oxford, OX1 3QU, UK. ²Εργαστήριο Ευκαρυωτικής Μεταγραφής, Marie Curie Research Institute, Surrey, RH8 0TL, UK.

Η ακετυλίωση των ιστονών παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στη δυναμική της χρωματίνης και έχει συνδεθεί με την αναδιοργάνωση της χρωματινικής δομής που απαιτείται για την μεταγραφική ενεργοποίηση αρκετών ευκαρυωτικών υποκινη-τών. Έτσι η ενεργοποίηση του PHO5 υποκινητή χαρακτηρίζεται από μία αναδιάταξη της χρωματίνης που οδηγεί στην απομάκρυνση 4 νουκλεοσομάτων από αυτόν. Δείχνεται στην παρούσα εργασία ότι η θέση των νουκλεοσομάτων, η αναδιοργάνωση της χρωματίνης και η μεταγραφική ενεργοποίηση στον φυσιολο-γικό ενδογενή PHO5 υποκινητή είναι ανεξάρτητες της ακετυλίωσης του αμινο-τελικού άκρου της ιστόνης Η4. Επίσης η ακετυλίωση του άκρου της Η3 και η ακεραιότητα των αμινοτελικών άκρων των Η3 και Η2B δεν επηρεάζουν την ρύθμιση του PHO5. Εντούτοις κάτω από συνθήκες που οδηγούν σε αλλαγή της θέσης των νουκλεοσομάτων πάνω από τον PHO5 υποκινητή τότε και μόνο τότε η ενεργοποίηση του υποκινητή εξαρτάται από την ακεραιότητα και την δυνατότητα ακετυλίωσης των αμινοτελικών άκρων των ιστονών. Συγκεκριμένα η μεταγραφική ενεργοποίηση ενός πλασμιδικού PHO5 υποκινητή συζευγμένου με το γονίδιο της β-γαλακτοσιδάσης, ο οποίος παρουσιάζει χαρακτηριστική αλλαγή των θέσεων των νουκλεοσομάτων, εξαρτάται από την ακετυλίωση του αμινοτελικού άκρου της Η4. Επίσης το αμινοτελικό άκρο της Η2B εμπλέκεται στην μερική ενεργοποίηση του PHO5 στο Δpho80/Δgcn5 στέλεχος ζύμης, όπου παρατηρείται μία παρόμοια αλλαγή στις θέσεις των νουκλεοσομάτων. Επομένως η δομή της χρωματίνης πάνω από τον υποκινητή του PHO5 καθορίζει την εξάρτηση της μεταγραφικής του ενεργοποίησης απο την ακετυλίωση των αμινοτελικών άκρων συγκεκριμένων ιστονών. Σε αντίθεση με το PHO5 η έκφραση του PHO3 εξαρτάται από παράγοντες που ανήκουν σε τρεις κατηγορίες ενζύμων με την ικανότητα να τροποποιούν μετα-μεταφραστικά την χρωματίνη: ακετυλάσες των ιστονών (Gcn5p), αποακετυλάσες των ιστονών (Rpd3p) και ATP-εξαρτώμενες μεγαλομοριακές μηχανές που αναδιοργανώνουν την χρωματίνη (Swi2p και Isw2p).