ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ: ΑΠΟ ΤΟΝ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟ ΤΗΣ ΔΟΜΗΣ ΣΤΗΝ ΑΝΑΖΗΤΗΣΗ ΤΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ

ΝΙΚΟΣ Κ. ΜΟΣΧΟΝΑΣ

ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ, ΠΑΝ/ΜΙΟ ΚΡΗΤΗΣ & ΙΜΒΒ-ΙΤΕ, ΗΡΑΚΛΕΙΟ, ΚΡΗΤΗ

Μια υπεδεκαετής προσπάθεια  για τον προσδιορισμό της δομής και της χρωμοσωμικής οργάνωσης του DNA του ανθρώπου έχει σχεδόν, ολοκλη-ρωθεί. Στους στόχους αυτής της προσπάθειας περιλαμβάνεται η κατασκευή χρωμοσωμικών χαρτών υψηλής ευκρίνειας, η αλληλούχιση του γενετικού υλικού και ο προσδιορισμός της θέσης όλων των γονιδίων, η μελέτη της γενετικής ποικιλότητας του ανθρώπου και παράλληλα, η ανάλυση του γενετικού υλικού οργανισμών-μοντέλων όπως ο σακχαρομύκητας, η δροσόφιλα και ο ποντικός. Εκτός από την αυταπόδεικτη συνεισφορά στην απάντηση βασικών βιολογικών ερωτημάτων, το Πρόγραμμα Ανάλυσης του Ανθρώπινου Γονιδιώματος προσφέρει την συστηματική καταγραφή της πληροφορίας για τη δομή, την οργάνωση και τη λειτουργία του ανθρώπινου DNA σε συνθήκες ελεύθερης πρόσβασης, έτσι ώστε τα αποτελέσματα να αξιοποιηθούν το γρηγορότερο δυνατόν για τη βελτίωση του επιπέδου διαβίωσης, αλλά και την ανάπτυξη πληθώρας νέων εφαρμογών στην βιοϊατρική και την βιοτεχνολογία. Η ογκώδης πληροφορία για την δομή και την οργάνωση των χρωμοσωμάτων και των γονιδίων του ανθρώπου, προστίθεται στην αντίστοιχη πρωτογενή γνώση για τους οργανισμούς-μοντέλα. Ομως για τη θεμελιώδη λειτουργία και την αλληλοσυνενόηση των βιολογικών μακρομορίων, η πληροφορία είναι ελάχιστη. Νέα επιστημονικά πεδία, όπως η Πρωτεομική και η Συγκριτική Γονιδιωματική, καλούνται να συνεισφέρουν σε θεμελιώδη βιολογικά ερωτήματα. Τεχνολογίες όπως αυτή των μικροσυστοιχειών DNA επιτρέπουν την σύγκριση της γονιδιακής ενεργότητας φυσιολογικών ή μεταλλαγμένων κυτταρικών τύπων, προσδιο-ρίζουν γονιδιακές παρεκκλίσεις και επιτρέπουν την μοριακή σταδιογράφιση των ασθενειών. H Βιοπληροφορική, με καθοριστική συνεισφορά στην καταγραφή και πρωτογενή αξιολόγηση της γενετικής πληροφορίας, καλείται πλέον να επινοήσει αποτελεσματικότερες μεθόδους αξιοποίησης των πειρα-ματικών δεδομένων. Με την ολοκλήρωση της χαρτογράφησης, η βιολογική έρευνα και τεχνολογική ανάπτυξη εισέρχονται σε μια ιδιαίτερα γόνιμη περίοδο. Η απάντηση σε βασικά βιολογικά ερωτήματα απαιτεί πλέον την συνδυασμένη έρευνα και στενή συνεργασία επιστημόνων από την Βιολογία, τη Φυσική, τη Μικροχημεία, την Πληροφορική, τη Μηχανική. Η νέα Βιολογία, σταδιακά, θα μας αποκαλύψει τον μικρόκοσμο της έμβιας ύλης, ένα πολυδιάστατο «χώρο» που ξεπερνά κατά πολύ την καταγραφή 40,000 γονιδίων. Οφείλουμε να τον κατανοήσουμε, να σεβαστούμε την ιστορία του και να τον διαχειριστούμε σωστά.

ΦΥΣΙΚΗ ΧΑΡΤΟΓΡΑΦΗΣΗ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΝΕΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΤΗΣ ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΗΣ ΠΕΡΙΟΧΗΣ 10q23.3-q25.1 TOY AΝΘΡΩΠΟΥ

Σαραφίδου¹ Θ., L. French², C. Nobile³, M. Kοκκινάκη¹, Π. Δελούκας² και N. K. Mοσχονάς¹

¹Dept. of Biology, U. of Crete and Inst. of Molec. Biol. & Biotech. - FORTH GR, Heraklion 711 10, Greece, ²The Sanger Centre, Hinxton, Cambridge CB10 1SA, UK, ³CNR Institute of Molecular Genetics, Alghero, 07041 Sassari, Italy

Στη χρωμοσωμική περιοχή 10q23.3-q25.1 (~25Mb), έχουν χαρτογραφηθεί αρκετές γενετικές ασθένειες για τις οποίες δεν έχουν ταυτοποιηθεί
 ακόμη τα υπεύθυνα γονίδια. Για την απομόνωση και ανάλυση γονιδίων της περιοχής που σχετίζονται με νοσήματα,  κατασκευάστηκε ένας
 υψηλής ευκρίνειας φυσικός χάρτης κλώνων BAC σχηματίζοντας ένα ενιαίο contig μήκους ~36Mb και απομονώθηκαν αρκετοί κλώνοι
 cDNA πλήρους μήκους. Κατά την πορεία αναζήτησης υποψηφίων γονιδίων υπεύθυνων για την μερική επιληψία κροταφικού λοβού (ΕΡΤ) 
προσδιορίσαμε τη γενωμική οργάνωση εννέα γονιδίων συνδεδεμένων με τον δείκτη D10S577. Τα γονίδια βρίσκονται σε περιοχή <250kb
 με την σειρά: cen, PGAM1, hCSL4, #3077, hMMS19, #51949, #304805, #569272, #44050, #25300, ter. Οι διαγονιδιακές αποστάσεις είναι
 από 0.2 έως 1.5kb υποδεικνύοντας την πιθανή χρησιμοποίηση κοινών  cis ρυθμιστικών στοιχείων από γειτονικά γονίδια. Τα γονίδια #3077
, hMMS19, #569272 και #44050 αποτελούνται από 12, 31, 6 και 4 εξώνια, αντιστοίχως. Ανάλυση Northern έδειξε ότι τα γονίδια εκφράζονται
 σε διάφορα όργανα συμπεριλαμβανομένου του εγκεφάλου. Το #3077 κωδικοποιεί μία πιθανή διαμεμβρανική πρωτεΐνη με το συντηρημένο
 μοτίβο δακτύλου ψευδαργύρου DHHC. To #51949 αποτελείται από 3 εξώνια και κωδικοποιεί μία πρωτεΐνη με το συντηρημένο μοτίβο
 ουβικουιτίνης. Η πρωτεΐνη 569272 εμφανίζει σημαντική δομική ομολογία με την συνθετάση του διυδροδιπικολινικού οξέος των βακτηρίων
 και των φυτών και με την λυάση του ΝΑΝΑ. Τέλος, η πρωτεΐνη 44050 περιέχει δύο μοτίβα  MORN (Membrane Occupation and Recognition
 Nexus).  Σχεδιάζεται η ολοκλήρωση της μοριακής ανάλυσης των παραπάνω γονιδίων και η διερεύνηση της ύπαρξης μεταλλαγών σε 
ασθενείς με ΕΡΤ και επιπλέον η απομόνωση και ο χαρακτηρισμός επιπλέον μορίων cDNA in vitro και in silico.  

ΜΟΡΙΑΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ NEURALIZED ΤΟΥ ΠΟΝΤΙΚΟΥ

Παυλόπουλος^1,2 H.K., Ε. Κουτέλου¹, Θ. Μητσιάδης³, Κ. Δελιδάκης^1,2  και Ν.Κ. Μοσχονάς^1,2

¹Παν. Κρήτης, Τμ. Βιολογίας, Ηράκλειο, ²Ινστιτούτο Μοριακής Βιολογίας & Βιοτεχνολογίας, ITE, ³Université de la Méditerranée, Faculté d’Odontologie, Marseille, France

Βασικός στόχος του «Προγράμματος Ανάλυσης του Ανθρώπινου Γονιδιώ-ματος» είναι η ανάλυση νέων γονιδίων βασιζόμενη σε ποικίλες προσεγ-γίσεις όπως αυτή της Συγκριτικής Γονιδιωματικής. Για την ανάλυση γονιδίων στη χρωμοσωμική περιοχή 10q23.3-25.1, όπου χαρτογραφούνται γενετικοί τόποι σχετιζόμενοι με ασθένειες, μελετήσαμε το θηλαστικό ομόλογο του γονιδίου neuralized της Drosophila, ένα νευρογόνο γονίδιο που εκφράζεται σε ποικίλους ιστούς κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης και συμμετέχει σε διαδικασίες διακυτταρικής επικοινωνίας με κύριο ρυθμιστή τον υποδοχέα Notch. Το ανθρώπινο γονίδιο (hNEURL) χαρτογραφείται στη θέση 10q25.1, το πιο συχνό χρωμοσωμικό έλλειμμα σε αστροκυττώματα. Έχει υποτεθεί ότι το hNEURL πιθανά να εμπλέκεται στις διαδικασίες καθορισμού της κυτταρικής τύχης στο νευρικό σύστημα και η καταστολή του να σχετίζεται με τη δημιουργία καρκινικών νευροεκτοδερμικών όγκων. Εξαιτίας της σπουδαιότητάς του στους αναπτυξιακούς μηχανισμούς των θηλαστικών, απομονώσαμε και αναλύσαμε το ομόλογο γονίδιο στο ποντίκι (mNeurl). Το γονίδιο mNeur αρχίζει τη δράση του από τα πρώτα εμβρυϊκά αναπτυξιακά στάδια σε ιστούς εκτοδερμικής και μεσοδερμικής προέλευσης, και η πρωτεΐνη εντοπίζεται στην κυτταρική μεμβράνη και σε στικτώδεις κυτταροπλασματικές δομές. Κατευθυνόμενη υπερέκφραση σε έμβρυα και προνύμφες Drosophila έδειξε ότι η δροσοφιλική πρωτεΐνη σχετίζεται με την κυτταροπλασματική πλευρά της κυτταρικής μεμβράνης. Εκτοπική υπερέκφραση του δροσοφιλικού ή ποντικίσιου διαγονιδίου είχε παρόμοια αποτελέσματα στα ενήλικα, διακοπή του ορίου του φτερού, πάχυνση φλεβών και καταστολή της έκφρασης του γονιδίου E(spl)m8 υποδεικνύοντας απώλεια λειτουργίας του Notch. Τα παραπάνω στοιχεία υποδεικνύουν τη λειτουργική συγγένεια του θηλαστικού και δροσοφιλικού neuralized και τη βιολογική του σπουδαιότητά στην ανάπτυξη από τα έντομα μέχρι τα θηλαστικά.

ΣΥΣΤΗΜΑΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΕΝΟΣ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΟΣ:  ΤΟ ΜΟΝΤΕΛΟ ΤΗΣ ΖΥΜΗΣ

Δέσποινα Αλεξανδράκη

Παν/μιο Κρήτης-Τμήμα Βιολογίας και ΙΤΕ-ΙΜΒΒ, Τ.Θ. 1527, Ηράκλειο, 711 10 Κρήτη. Τηλ: 081391161, Φαξ: 081391101, Ηλ.Ταχ.: alexandr@imbb.forth.gr

Η πλήρης αλληλούχιση του γονιδιώματος διαφόρων οργανισμών παρέχει την δυνατότητα ταυτοποίησης όλων των γονιδίων και πρωτεϊνών, όλων των αλληλεπιδράσεων μεταξύ μακρομορίων και διευκολύνει την κατανόηση των μηχανισμών που μετατρέπουν την γονιδιακή πληροφορία σε συγκε-κριμένους φαινοτύπους. Επιπλέον, επιτρέπει ολοκληρωμένη διερεύνηση της ποικιλότητας και εξέλιξης των μορίων, της ζωής σε ιδιαίτερα περιβάλλοντα και την εκμετάλλευση της ιδιαιτερότητας των ειδών για βελτίωση των πηγών τροφής, ενέργειας και θεραπείας. Χιλιάδες γονίδια και πρωτείνες παρέμεναν άγνωστα ακόμα και σε συστήματα που είχαν αναλυθεί εκτενώς γενετικά και φαινοτυπικά, όπως ο σακχαρομύκητας. Οι νέες μεθοδολογίες συστηματικής ανάλυσης της λειτουργίας γονιδίων και πρωτεϊνών βασίζο-νται σε συνδυασμό αρχών χημείας, βιοχημείας, φυσικής, μηχανικής, μορια-κής γενετικής και υπολογιστών. Το πρώτο αποκωδικοποιημένο ευκαρυ-ωτικό γονιδίωμα, του S. cerevisiae, αποτελεί μοντέλο λειτουργικής ανάλυ-σης του συνόλου των μεταγράφων, πρωτεϊνών και μεταβολιτών σε έναν μονοκύτταρο οργανισμό με 6000 γονίδια. Υπάρχει ήδη η συλλογή στελεχών αφαίρεσης κάθε ενός γονιδίου, ανεκτίμητο εργαλείο για φαινοτυπικές δοκιμασίες, ανεύρεση της κυτταρικής θέσης κάθε πρωτείνης και  ταυτοποίηση μοναδικών πρωτεϊνικών στόχων για κάθε φάρμακο. Συνολική ανάλυση μεταγράφων, από μεταλλαγμένα στελέχη καλλιεργημένα σε ποικίλες συνθήκες, με μικροσυστοιχίες DNA αποκάλυψαν και κατηγοριο-ποίησαν συν-ρυθμιζόμενα γονίδια. Ποσοτική πρωτεωμική, ανάλυση δομών και τροποποιήσεων και βιοχημική δράση πρωτεϊνών επιτυγχάνεται με 2D ηλεκτροφόρηση, φασματοσκοπία μάζας συμπλόκων, αλληλεπίδραση δύο υβριδίων in vivo, έκθεση σε φάγους και πρωτεϊνικές συστοιχίες. Οι πρωτείνες λειτουργούν αλληλεπιδρώντας με άλλες πρωτείνες. H ανεύρεση δικτύων αλληλεπιδράσεων απεκάλυψε  ‘συνομιλίες’ άσχετων μονοπατιών και υπέδειξε ρόλους νέων πρωτεϊνών από την αλληλεπίδρασή τους με πρωτείνες γνωστής λειτουργίας.

ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ ΑΠOΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΗΣ-Ε ΣΤΗΝ ΑΘΗΡΟΓΕΝΕΣΗ ΚΑΙ ΤΗ ΝΟΣΟ ΤΟΥ ALZHEIMER: ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ

Βασίλης Ι. Ζαννής^1,2 και Κυριάκος Κυπραίος¹

¹ Section of Mol. Genetics, Whitaker Cardiovascular Institute, Boston Univ., School of Medicine, Boston, MA; ² Παν/μιο Κρήτης, Τμήμα Βιοχημείας και Ινστ. Μορ. Βιολογίας και Βιοτεχ/γίας, Ηράκλειο Κρήτης

Χρησιμοποιήσαμε γονιδιακή μεταφορά μέσω αδενοϊών σε ποντικούς με ανεπάρκεια της Απο-Ε, για να προσδιορίσουμε τις περιοχές της Απο-Ε που απαιτούνται για την ομοιόσταση της χοληστερόλης και των τριγλυκεριδίων. Eνεση σε ποντικούς με  αδενοϊούς που εξέφραζαν την Απο-Ε2, Ε3 ή Ε4 μείωσε ελαφρά τα επίπεδα χοληστερόλης των ποντικών και προκάλεσε σοβαρή υπερτριγλυκεριδαιμία, λόγω της συσσώρευσης στο πλάσμα VLDL-εμπλουτισμένης σε χοληστερόλη και τριγλυκερίδια. Σε αντίθεση, οι ελλειματικές μορφές της Απο-Ε, που στερούνται τις καρβοξυ-τερματικές τους περιοχές, προκάλεσαν 90% μείωση των επιπέδων χοληστερόλης του πλάσματος, αλλά δεν επηρέασαν τα επίπεδα των τριγλυκεριδίων των ποντικών. Συνδυασμένη υπερλιπιδαιμία εδημιουργήθη σε κανονικούς ποντικούς μετά από ένεση με αδενοϊούς που εκφράζουν την Απο-Ε πλήρους μήκους. Η έκκριση της Απο-Ε από κυτταροκαλλιέργειες και τα επίπεδα mRNA του ήπατος σε επιμέρους ποντικούς που εκφράζουν την Απο-Ε πλήρους μήκους και τις ελλειμματικές μορφές της Απο-Ε, ήταν παρόμοια. Αντίθετα, η έκκριση των VLDL τριγλυκεριδίων σε ποντικούς που εκφράζουν την Απο-Ε4, αλλά όχι τις ακρωτηριασμένες μορφές  ήταν αυξημένη 10 φορές, σε σύγκριση με την έκκριση της VLDL σε ποντικούς που είχαν μολυνθεί με αδενοϊούς μάρτυρες. Συνολικά οι παρατηρήσεις μας δηλώνουν ότι η αμινο-τερματική περιοχή 1-185 της Απο-Ε επαρκεί για την πρόσδεσή της σε λιποπρωτεϊνες και για την απομάκρυνση των εν λόγω λιποπρωτεϊνών in vivo, ενώ η καρβοξυ-τερματική περιοχή 260-299 της Απο-Ε συνεισφέρει στην υπερτριγλυκεριδαιμία. Η υπερτριγλυκεριδαιμία σε Ε-/- ποντικούς προέρχεται, εν μέρει, από αυξημένη έκκριση της VLDL. Οι παρατηρήσεις μας με κανονικούς ποντικούς,  φανερώνουν ότι η υπερέκφραση της Απο-Ε πλήρους μήκους προκαλεί έκκριση VLDL εμπλουτισμένης σε τριγλυκερίδια, που δεν μπορεί να καταβολιστεί περαιτέρω και προκαλεί συνδυασμένη υπερλιπιδαιμία. Η υπερτριγλυ-κεριδαιμία, που προκαλείται από την υπερέκφραση της Απο-Ε, ελαττώνει σημαντικά τη θεραπευτική της αξία. Η αδυναμία των ελλειμματικών μορφών της Απο-Ε, που στερούνται την καρβοξυ-τερματική τους περιοχή, να επάγουν υπερτριγλυκεριδαιμία, σε συνδυασμό με την ικανότητά τους να απομακρύνουν τη χοληστερόλη, ενισχύει την πιθανότητα χρήσης τους στο μέλλον για γονιδιακή θεραπεία που θα επιδιορθώσει ασθένειες που χαρακτηρίζονται από συσσώρευση υπολειμμάτων λιποπρωτεϊνών. Η συνεισφορά της Απο-Ε στην ομοιόσταση της χοληστερόλης συμβάλλει στην προστασία από την αθηρωμάτωση. Επιπλέον, ο ρόλος της Απο-Ε στην ομοιόσταση της χοληστερόλης στον εγκέφαλο, σε συνδυασμό με την ικανότητα των ισομορφών της Απο-Ε να προσδένονται με διαφορετική συγγένεια στο αμυλοειδές πεπτίδιο β, ενδέχεται να συμβάλλουν στη συσχέτιση της Απο-Ε4 με τη νόσο του Alzheimer στους υπερήλικες.